新たなイメージング技術を駆使し、学習中の脳内神経細胞で働く分子を追跡可能に
私たちが学習しているとき、脳の中では神経ネットワークの構造が変化しています。構造の変化には様々な現象がありますが、そのひとつとして、神経細胞同士の接合点である”シナプス”が、学習に伴って新たに形成されることがわかっています。私たちの研究室では、個体の脳を生きたまま観察するシステムを開発し、神経細胞にフォーカスして、学習中のシナプス形成に関わる分子の動きをライブで中継する試みに取り組んでいます。研究の軸をライブイメージング技術の向上に据えていますが、学習や記憶などを専門とする多くの研究者とも議論をしながら研究を進めています。
シナプス終末に運ばれるメッセンジャーRNAがシナプス形成のカギ
脳はいかようにも変化する”可塑性”を持つ組織です。脳の神経細胞が繰り返し刺激を受けると新たなシナプスが形成されて、情報伝達の効率が変化します。つまり、シナプス形成はまさしく学習の工事現場と言えるのです。では、ここではいったいどのような分子が働いているのでしょう？過去の研究で、神経伝達物質のセンソリン（sensorin）というタンパク質のメッセンジャーRNA(mRNA)は、核周辺に留まらずシナプス終末にまで運ばれ濃縮されていて、神経細胞が入力刺激を受けるとタンパク質に翻訳されることがわかっていました。その翻訳を阻害すると、シナプス形成が起こらないことも確認されました。このことから、センソリンのメッセンジャーRNAの神経末端への移動と翻訳がシナプス形成に重要であるといえます。
ここまでわかると、次の疑問が湧いてきました。どうやってmRNAが核からシナプス終末までの遠距離を移動しているのか？どうやってシナプス終末で翻訳が開始されるのか？そして、センソリンはどのようなメカニズムでシナプス形成に働くのか？これらの分子メカニズムを追求するために、私たちはイメージング技術を駆使して、研究を行っています。
まず、センソリンのmRNAの微細な局在を観察するために、蛍光in situ ハイブリダイゼーション法（FISH法）というイメージング技術を取り入れ、mRNAそのものを蛍光物質で標識し観察を行いました。さらにmRNAの様々な断片を作って観察を繰り返したところ、センソリンのmRNAがシナプス終末に移動するには、5’側のUTRにある66塩基が重要であるというところまで突き止めることができました。
生体内でメッセンジャーRNAの動きを観察できるイメージング手法を開発
核から出てきたmRNAがシナプス終末まで移動するということに確証が持てたので、次に、私たちはRNAの動きをライブでイメージングする手法を開発しました。従来行っていた上述のFISH法では、生きた細胞の染色はできません。その理由は、蛍光色素にあります。FISH法で使用するFITCやCy5といった色素は、励起光さえ当てれば蛍光を発します。そのため、過剰に投与したプローブ分子を洗い流さなければ、細胞全体が光ってしまいます。観察像を壊さずにプローブ分子を洗い流すためには、まず細胞を固定する必要があるため、結果的に細胞を殺さなければならないのです。
この問題を解決するために岡本晃充先生（現東京大学大学院工学研究科教授）とともに開発したのが、ターゲット配列に結合した時だけ蛍光を発することができる色素チアゾルオレンジです。結合していない時は励起光を当てても光らないため、洗浄の必要がなくなり、生きた細胞に投与するだけで観察できるようになります。ECHO-FISHと名付けたこの方法により、これまで不可能だった内在性mRNAのライブイメージングが可能になりました。さらに、人工的に培養した層の薄い神経細胞ではなく、生きたマウスの脳など、厚みのある組織中のRNAの挙動を観察することにも成功したのです。実際、マウス胎児の脳内で特定の神経細胞を染色し、数日後にその細胞がどのように移動したのかを見ることにも成功しています。
生体内イメージングで記憶学習のメカニズムに更に近づく
次に展開する研究では、ECHO-FISH法を使って、「現実の学習」により近い状況を設定して、分子の挙動をとらえていきたいと考えています。具体的には、映像やスイッチなどを使って水やエサといった報酬を得る学習課題をマウスに行わせ、対象のマウスの脳にこのプローブを投与することを予定しています。そうすれば、その学習過程の中で、脳のどの部位でシナプス形成が起こっているのかを観察できるはずです。こうした観察を発展させていけば、複雑な脳がどのようにネットワークを構築していくのかを調べることができ、最終的には意識や人格といったものが形成されるしくみの解明に近づけるかもしれません。
ただし、その夢への道にはまだ課題があります。技術面ではシグナルのターゲティングが本当に成功しているのかを検証する方法や、さらにシグナルの感度を上げて深い部位を観察する技術を作りたいし、生体へのダメージをより小さくする必要もあります。また研究設計面では、どういった実験の際にどこを観察するのか、といったことも考える必要があります。学習や記憶の専門家など多くの研究者と議論していくことで、これらの課題を解決し、私たちの大きな関心である学習時の脳のしくみの解明に近づいていきたいと考えています。
生きている動物の脳内をイメージングする
研究室HP
http://www.ohtan.icems.kyoto-u.ac.jp/
主要論文
- Wang DO, Kim SM, Zhao Y, Hwang HG, Miura SK, Sossin WS, and Martin KC, “Synapse-and stimulus-specific local translation during long-term neuronal plasticity” Science 324(5934): 1536-40, 2009.
- Wang DO*, Hitomi Matsuno, Shuji Ikeda, Hiroyuki Yanagisawa, Yasunori Hayashi, and Akimitsu Okamoto*, “A quick and simple FISH protocol with hybridization-sensitive fluorescent linear oligodeoxynucleotide probes” RNA 18(1):166-75, 2012.
- Oomoto I, Hirano-Suzuki A, Umeshima H, Han YW, Yanagisawa H, Carlton P, Harada Y, Kengaku M, Okamoto A, Shimogori T, and Wang DO, “ECHO-liveFISH: in vivo RNA Labeling Reveals Dynamic Regulation of Nuclear RNA Foci in Living Tissues” Nucleic Acids Research doi:10.1093/narlgkv614, 2015.